ההנחה בבדיקת הפוליגרף היא כאשר אנחנו משקרים, התגובות הפיזיולוגיות שאינן נשלטות על ידנו מניבות תגובות שניתנות לאבחון כתגובות שקר. השינויים באים לידי ביטוי בעליית לחץ הדם, שינויים בדופק, הזעה מוגברת, קצב נשימה משתנה ועוד .
מערכות הגוף הפיזיולוגיות של האדם אינן ניתנות לשליטה במצבי לחץ, ולכן כאשר הנבדק אינו דובר אמת במהלך בדיקת הפוליגרף כל המערכות הפיזיולוגיות יצביעו על תגובות של שקר.
בדיקת הפוליגרף נחלקת למספר שלבים כאשר השלב הראשון הוא שיחה מקדימה עם הנבדק, לימוד נושא הבדיקה, בדיקת נכונותו של הנבדק להיבדק בפוליגרף מרצונו הטוב והחופשי ובדיקת מצבו הבריאותי באם מאפשר לבצע את בדיקת הפוליגרף . במהלך השיחה מציג הנבדק מסמכים במידה וישנן כאלו ובונים שאלות רלוונטיות שמזמין הבדיקה או הנבדק בעצמו רוצה להישאל עליהם.
שאלות הבדיקה תהיינה שאלות שהנבדק מסכים להישאל עליהם, הוא מבין אותם, ותשובותיו סותרות את החשד עליהם הוא נבדק והביע את רצונו לכך. שאלות הבדיקה יהיו קצרות ככל הניתן ותשובות הנבדק יהיו ברורות וחד משמעותיות. תשובות לשאלות הבדיקה תינתנו בחיוב או שלילה בלבד.
לאחר הכנת הנבדק ובניית שאלות לבדיקת הפוליגרף מחברים את הנבדק לחיישני פוליגרף על מנת לרשום את התגובות הפיזיולוגיות. הנבדק ישאל במהלך בדיקת הפוליגרף מספר פעמים את השאלות שסוכם בזמן שהוא מחובר לחיישני הפוליגרף .
לאחר סיום הבדיקה מפענח בודק הפוליגרף את תרשימי הבדיקה ועל פי עוצמות התגובות הפיזיולוגיות
שהתקבלו יחליט באם הנבדק דובר אמת או שקר.